形态学鉴定法鉴别松材线虫,实际操作过程中有什么难点?

发表时间:2021-04-19 15:10

日常监测普查中,我们一旦发现松树枯死、松针变色等异常情况,应当立即按照《松材线虫病防治技术方案》(林生发〔2018〕110号)中有关要求进行取样鉴定,确认是否感染松材线虫病。


目前鉴定松材线虫的方法很多,其中形态学鉴定法是专业人员较常用的一种鉴定方法。


松材线虫形态学鉴定方法包括取样、分离和鉴定三个环节。


一、取样

1、松树选择

在重点监测区域的死亡原因不明的枯死松树,都应采样,机械损伤、火灾等死亡原因明确的非由松材线虫病引起的死亡不用取样。

尽可能选择刚枯死或尚未完全枯死的优势木,如需取样枯死时间超过1 a的松树,应当取心材,而不要取边材。


2、取样部位

整株枯死的松树,在树干上(主侧枝交界处)、中、下(胸高处)三个部位取样。在树干内发现媒介昆虫虫蛹的,优先在蛹室周围取样


3、取样方式

分块状取样和手钻取样两种方式。


块状取样是在取样部位采集木质部100~200 g,为避免钻取木屑时温度超过50℃、迅速杀死松材线虫,不能采取手钻钻取取样。复检松材及其制品时,应首先了解原产地,若来自疫情发生区,需尽可能块状取样,为避免样品少分离不出线虫,样品质量应大于200 g。


对于无法块状取样,可用较大手钻取样,手钻越小,取样造成的线虫死亡数量就越多


样品保存

l   记录样品并编号,填写标签,包括样品编号、取样地点、树种、树龄、部位、采集时间、取样人等信息,存装备用。


l   春、秋、冬季采集的样品可在常温下用塑料袋保湿存装备用,夏天采集的样品要避免高温高湿。采集回的样品应及时分离鉴定。



二、分离

分离原理

线虫个体小、身体密度大于水,可穿过纱布,受重力作用会下沉,且具有亲水性,遇水会从植物体或媒介昆虫体内游出。

分离方法

传统贝尔曼漏斗法分离,将块状或段木样品的心材加工成小颗粒或碎木片,用纱布或面巾纸包好,置于漏斗内,注入清水浸没进行分离,时间一般为12 h。


夏季气温高,线虫活跃,分离需时较短,分离2 h后,用手持放大镜通过漏斗颈观察是否有线虫游出,如果观察到线虫数量较多,则4~8 h就可用来镜检;如果线虫数量较少,适当延长时间,也可将段木短时间浸水后,保湿保养2~3 d后重新分离。


冬季温度较低,线虫不够活跃,分离需时24~48 h。如果线虫数量较少,又不具备培养条件,可多采几次样,多次分离。


松材线虫洗滤分离器

松材线虫洗滤分离器.jpg
松材线虫组合式洗滤分离器.jpg

生兴防治松材线虫洗滤分离器,基于贝尔曼漏斗法原理改进设计,样本经过简便的浸泡、搅拌、洗滤、过滤等步骤即可分离出线虫。



三、镜检

  • 排除腐生线虫

先在显微镜下观察,看到线虫后调到更高倍显微镜,能清晰看到口针、中食道球、雄性生殖器。

如果没有口针说明是腐生线虫。如果有口针、中食道球、雄性生殖器,说明可能是松材线虫或拟松材线虫,需进一步观察。

  • 区分雄雌虫


  • 雄虫尾部

    松材线虫雄虫尾部.png

    雌虫尾部

    松材线虫雌虫尾部.jpg

看到的松材线虫或拟松材线虫雄成虫尾部呈鱼钩状(弓状交合刺),雌成虫的虫体接近直线,大约在尾部1/3至1/4(阴门处)略弯曲。


松材线虫镜检为何要重点观察雌虫?

形态学鉴别松材线虫的最大难点在于区分与松材线虫同属的无致病性或致病力弱的拟松材线虫,而松材线虫和拟松材线虫雄成虫在形态上几乎完全相同,因此在做形态鉴定时重点观察雌虫,雌虫尾部的特征是区分松材线虫和拟松材线虫的一个重要指标。



  • 重点观察雌成虫

图片

线虫雌虫的尾部

(图源:南开大学学报:自然科学版, 第41卷第5期)

显微镜下观察雌成虫,如果没有阴门盖,就可以排除松材线虫,如果有阴门盖,则是松材线虫或拟松材线虫。


再观察线虫的尾部,拟松材线虫尾呈圆锥形,末端较尖,且有一明显的指状突起(尾尖突),尾尖突长度超过2 μm;松材线虫的尾呈亚圆柱形,末端宽圆,无尾尖突(偶有群体内个别有微小的尾尖突,但短于2 μm)。


通过以上步骤,你知道怎样用形态鉴定法鉴别出松材线虫了吗?多数情况下松材线虫形态鉴定特征还是比较明确的,我们主要掌握以下3点:

1、 雄虫典型的较大弓状交合刺;

2、 雌虫较长的阴门盖(长7~11 μm);

3、 雌虫尾呈亚圆柱形,末端宽圆,尾尖突不超过2 μm。


虽然松材线虫的形态鉴定方法有一定的缺陷,但是目前,全国松材线虫疫情爆发激烈、基层森防站防治任务大、实验室条件简陋的现实情况下,该方法简便易行,仍然有较大的实用性。如果我们能够牢牢把握采样、分离、鉴定等几个环节的工作质量,注意细节要领,也会得到准确的结果。EN

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参考资料:

[1]张斌善, 熊小娟, 付园, et al. 鉴定松材线虫病的形态学方法[J]. 陕西林业科技, 2016(2):116-117,共2页.

[1]韩增强, 张文萍. 松材线虫鉴定技术初探[J]. 河南林业科技, 2019, 039(002):32,54.

[1]俞春来,何洁,刘乐乐,顾建锋. 松材线虫雌虫尾尖突变化综述[J]. 安徽农业科学, 2017, 27(v.45;No.568):176-179.




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