形态学鉴定法鉴别松材线虫，实际操作过程中有什么难点？

日常监测普查中，我们一旦发现松树枯死、松针变色等异常情况，应当立即按照《松材线虫病防治技术方案》（林生发〔2018〕110号）中有关要求进行取样鉴定，确认是否感染松材线虫病。

目前鉴定松材线虫的方法很多，其中形态学鉴定法是专业人员较常用的一种鉴定方法。

松材线虫形态学鉴定方法包括取样、分离和鉴定三个环节。

一、取样

1、松树选择

在重点监测区域的死亡原因不明的枯死松树，都应采样，机械损伤、火灾等死亡原因明确的非由松材线虫病引起的死亡不用取样。

尽可能选择刚枯死或尚未完全枯死的优势木，如需取样枯死时间超过1 a的松树，应当取心材，而不要取边材。

2、取样部位

整株枯死的松树，在树干上（主侧枝交界处）、中、下（胸高处）三个部位取样。在树干内发现媒介昆虫虫蛹的，优先在蛹室周围取样。

3、取样方式

分块状取样和手钻取样两种方式。

块状取样是在取样部位采集木质部100~200 g，为避免钻取木屑时温度超过50℃、迅速杀死松材线虫，不能采取手钻钻取取样。复检松材及其制品时，应首先了解原产地，若来自疫情发生区，需尽可能块状取样，为避免样品少分离不出线虫，样品质量应大于200 g。

对于无法块状取样，可用较大手钻取样，手钻越小，取样造成的线虫死亡数量就越多。

二、分离

分离原理

线虫个体小、身体密度大于水，可穿过纱布，受重力作用会下沉，且具有亲水性，遇水会从植物体或媒介昆虫体内游出。

分离方法

传统贝尔曼漏斗法分离，将块状或段木样品的心材加工成小颗粒或碎木片，用纱布或面巾纸包好，置于漏斗内，注入清水浸没进行分离，时间一般为12 h。

夏季气温高，线虫活跃，分离需时较短，分离2 h后，用手持放大镜通过漏斗颈观察是否有线虫游出，如果观察到线虫数量较多，则4~8 h就可用来镜检；如果线虫数量较少，适当延长时间，也可将段木短时间浸水后，保湿保养2~3 d后重新分离。

冬季温度较低，线虫不够活跃，分离需时24~48 h。如果线虫数量较少，又不具备培养条件，可多采几次样，多次分离。

松材线虫洗滤分离器

生兴防治松材线虫洗滤分离器，基于贝尔曼漏斗法原理改进设计，样本经过简便的浸泡、搅拌、洗滤、过滤等步骤即可分离出线虫。

三、镜检

• 排除腐生线虫

先在显微镜下观察，看到线虫后调到更高倍显微镜，能清晰看到口针、中食道球、雄性生殖器。

如果没有口针说明是腐生线虫。如果有口针、中食道球、雄性生殖器，说明可能是松材线虫或拟松材线虫，需进一步观察。

• 区分雄雌虫

  
  

• 雄虫尾部

  

  雌虫尾部

  

看到的松材线虫或拟松材线虫雄成虫尾部呈鱼钩状（弓状交合刺），雌成虫的虫体接近直线，大约在尾部1/3至1/4（阴门处）略弯曲。

• 重点观察雌成虫

显微镜下观察雌成虫，如果没有阴门盖，就可以排除松材线虫，如果有阴门盖，则是松材线虫或拟松材线虫。

再观察线虫的尾部，拟松材线虫尾呈圆锥形，末端较尖，且有一明显的指状突起（尾尖突），尾尖突长度超过2 μm；松材线虫的尾呈亚圆柱形，末端宽圆，无尾尖突（偶有群体内个别有微小的尾尖突，但短于2 μm）。

通过以上步骤，你知道怎样用形态鉴定法鉴别出松材线虫了吗？多数情况下松材线虫形态鉴定特征还是比较明确的，我们主要掌握以下3点：